顯微鏡的光學(xué)原理及性能

顯微鏡的光學(xué)原理及性能

       傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡主要由光學(xué)系統(tǒng)及支撐它們的機(jī)械結(jié)構(gòu)組成，光學(xué)系統(tǒng)包括物鏡、目鏡和聚光鏡，都是由各種光學(xué)玻璃做成的復(fù)雜化了的放大鏡。物鏡將標(biāo)本放大成像，其放大倍率M物由下式?jīng)Q定：M物=Δ∕f’物 ，式中f’物是物鏡的焦距，Δ可理解為物鏡與目鏡間的距離。目鏡將物鏡所成之像再次放大，成一個(gè)虛像在人眼前250mm處供人觀察,這是多數(shù)人感覺最舒適的觀察位置，目鏡的倍率M目=250/f’目,f’目是目鏡的焦距。顯微鏡的總放大倍率是物鏡與目鏡的乘積，即M=M物*M目=Δ*250∕f’目*f;物。可見，減小物鏡及目鏡焦距將使總放大倍率提高，這是用顯微鏡可以看到細(xì)菌等微生物的關(guān)鍵,也是其與普通放大鏡的區(qū)別所在。
　　那么，是否可以設(shè)想無限制地減少f’物f’目，以便提高放大倍率，使我們能看到更加細(xì)微的物體呢?回答是否定的！這是因?yàn)橛靡猿上竦墓獗举|(zhì)是一種電磁波，因而在傳播過程中免不了產(chǎn)生衍射和干涉現(xiàn)象，就像日常所見水面的波紋遇到障礙時(shí)能繞行，兩列水波相遇時(shí)能互相加強(qiáng)或削弱一樣。當(dāng)從一個(gè)點(diǎn)狀的發(fā)光物點(diǎn)發(fā)出的光波進(jìn)入物鏡時(shí)，物鏡的邊框阻礙了光的傳播，產(chǎn)生衍射和干涉，經(jīng)物鏡后無法再會(huì)集于一點(diǎn)，而是形成有一定大小的光斑，外圍還有強(qiáng)度微弱并逐漸減弱的一系列光環(huán)，我們稱中心亮斑為艾里斑，兩個(gè)發(fā)光點(diǎn)靠近到一定距離時(shí)兩光斑就會(huì)重疊，直至無法確認(rèn)為兩個(gè)光斑。瑞利提出了一個(gè)判定標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為當(dāng)兩光斑中心相距等于艾里斑半徑時(shí)，兩光斑是能分辨的，經(jīng)計(jì)算，這時(shí)候兩個(gè)發(fā)光點(diǎn)間的距離e=0.61入∕n.sinA=0.61入∕N.A，式中，入為光波波長，人眼可接收的光波波長約為0.4—0.7um，n為發(fā)光點(diǎn)所處介質(zhì)的折射率，如處在空氣中，n≈1，處在水中，n≈1.33，而A為發(fā)光點(diǎn)對物鏡邊框張角之半，N.A稱為物鏡的數(shù)值孔徑。從上式可見，物鏡能分辨的兩點(diǎn)間的距離受到了光的波長和數(shù)值孔徑的限制，由于人眼視覺最敏銳的波長約為0.5um，而A角不可能超過90度，sinA總小于1，對于可用的透光介質(zhì)最大折射率約為1.5，故 e值始終大于0.2um，這是光學(xué)顯微鏡能分辨的最小極限距離。通過顯微鏡放大成像，若想將能被具有某些N.A值的物鏡分辨率的物點(diǎn)間距e放大到足以被人眼分辨，則需M.e≥0.15mm，此處0.15mm為實(shí)驗(yàn)得出的人眼能分辨的置于眼前250mm處兩微物間的最小距離，故M≥（0.15∕0.61入）N.A≈500N.A ，為使觀察不致太費(fèi)力，M擴(kuò)大一倍便足夠了，即500N.A≤M≤1000N.A，是顯微鏡總倍率的合理選取范圍，再大的總放大倍率是沒有意義的，因?yàn)槲镧R數(shù)值孔徑已經(jīng)限制了最小可分辨距離，提高放大倍率已不可能分辨出更小的物體細(xì)節(jié)了。
　　成像襯度是光學(xué)顯微鏡的另一個(gè)關(guān)鍵問題，所謂襯度，即是像面上相鄰部份間的黑白對比度或顏色差，人眼對于0.02以下的亮度差別是很難判定的，對顏色差別則稍微敏感一些。有些顯微鏡觀察對象，如生物標(biāo)本，其細(xì)節(jié)間亮度差別甚小，加之顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計(jì)制造誤差使其成像襯度進(jìn)一步降低而難于分辨，此時(shí)，看不清物體細(xì)節(jié)，不是總放大倍率過低，也不是物鏡數(shù)值孔徑太小，而是由于像面襯度太低的緣故。
　　多少年來，人們?yōu)樘岣唢@微鏡的分辨能力和成像襯度付出了艱辛的勞動(dòng)，隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)和工具的不斷進(jìn)步，光學(xué)設(shè)計(jì)的理論和方法也在不斷改進(jìn)，加上原材料性能的提高，工藝和檢測手段的不斷完善，觀察方法的創(chuàng)新，使光學(xué)顯微鏡的成像質(zhì)量已經(jīng)接近衍射極限的完善程度，人們將用標(biāo)本染色、暗場、相襯、熒光、干涉、偏光等觀察技術(shù)，使得光學(xué)顯微鏡已能適應(yīng)形形色色標(biāo)本的研究，雖然近年來電子顯微鏡，超聲顯微鏡等放大成像儀器先后問世，在某些方面具有優(yōu)勢的性能，但在廉價(jià)、方便、直觀、特別是適合生物活體的研究等方面仍無法與光學(xué)顯微鏡匹敵，光學(xué)顯微鏡仍然牢固地占據(jù)著自己的陣地。另一方面，與激光、計(jì)算機(jī)、新材料技術(shù)、信息技術(shù)相結(jié)合，古老的光學(xué)顯微鏡正煥發(fā)青春，顯示了旺盛的生命力，數(shù)碼顯微鏡、激光共焦掃描顯微鏡、近場掃描顯微鏡、雙光子顯微鏡及具有各種新的功能或能適應(yīng)各種新的環(huán)境條件的儀器層出不窮，更加擴(kuò)大了光學(xué)顯微鏡的應(yīng)用領(lǐng)域，作為最新的例子。從火星探測車上傳回的巖層顯微圖片是多么令人振奮！我們完全可以相信，光學(xué)顯微鏡將會(huì)以更新的姿態(tài)，造福人類。